The combined effect of oseltamivir and favipiravir on influenza A virus evolution in patients hospitalized with severe influenza
Article, 2023-8, Antiviral Research, [IF 7.6]
DOI: 10.1016/j.antiviral.2023.105657
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354223001353?via%3Dihub
主要完成单位：中日友好医院
通讯作者：曹彬（中日友好医院）邹晓辉（中日友好医院）
第一作者：穆生瑞（首都医科大学）邹晓辉（中日友好医院）王业明（中日友好医院）
其他作者：邓笑颜，崔丹，刘帅
摘要
流感病毒感染严重危害人类健康。既往研究表明与奥司他韦单药治疗重症流感患者相比，法匹拉韦（靶向RNA聚合酶）和奥司他韦（神经氨酸酶抑制剂）联合治疗可能加速临床患者康复，但联合治疗对流感病毒进化的影响以及是否会出现奥司他韦或者法匹拉韦耐药突变仍然未知。本研究纳入2018年2月至2019年2月经奥司他韦和法匹拉韦联合治疗的重症流感患者，在治疗期间纵向收集呼吸道样本。同时还收集一组未经任何抗病毒药物治疗的流感感染的患者呼吸道样本作为对照。所有样本进行流感病毒全基因组测序，分析联合治疗患者中流感病毒核苷酸多样性及非同义突变。最终联合治疗组中来自19位患者的62个呼吸道样本和对照组中来自20位患者的20个呼吸道样本成功完成全基因组测序。联合治疗组的流感病毒全基因组核苷酸多样性与对照组相比无显著差异（P>0.05）。此外在联合治疗的患者中观察到174种非同义突变，46/174（26%）在既往报道中提出有生物学意义，例如增加致病性和聚合酶活性。其中，在一个患者的所有样本中检测到奥司他韦耐药突变H275Y，且在联合治疗期间比例逐渐增加，但未曾观察到既往报道的法匹拉韦耐药相关突变。研究表明，法匹拉韦和奥司他韦联合治疗对病毒核苷酸多样性几乎没有影响，同时联合治疗也不能阻止奥司他韦耐药突变比例的增加。
引言
流感病毒严重危害人类健康。我们的前期研究证明在重症流感住院患者中，与奥司他韦单药治疗相比，法匹拉韦和奥司他韦联合治疗（“联合治疗”）可以加快患者临床康复。尽管理论上联合治疗有望使患者临床获益，但目前已知的流感特异性抗病毒药物都会导致耐药性突变的出现。流感病毒RdRp复合体的自发突变率约为2*10-4，导致病毒以准种的形式存在。所以很可能在抗病毒治疗和耐药性突变被药物压力筛选出来之前，携带耐药突变的病毒已经存在病毒准种之中。法匹拉韦是一种核苷酸类似物，通过掺入更多的错误碱基，导致流感病毒无法正确转录翻译，以至于病毒无法存活，最终走向灭绝。既往研究表明，法匹拉韦全局性地提高了RNA病毒的变异频率。突变的流感病毒如果有机会继续存活和增殖，可能会变得比之前更具传染性和致病性。与单独使用法匹拉韦相比，联合治疗可能提前病毒准种的灭绝时间点，但也存在引入与耐药相关的新突变的风险。既往研究报道，奥司他韦和法匹拉韦的联合治疗无法阻止感染甲型H1N1流感病毒的小鼠对奥司他韦的耐药，但是在临床患者中还未有耐药突变相关报道。联合治疗中的法匹拉韦会提高病毒的变异频率，在高突变率的推动下，突变体不断出现，并且随着病毒复制的进行，它们的相对频率发生变化，会改变流感病毒变异和进化趋势，再加上奥司他韦的正向选择作用，在这种变异和筛选压力下，流感病毒多样性变化以及是否会出现奥司他韦或者法匹拉韦耐药突变，是本研究要解决的科学问题（图1A）。
研究方法
研究纳入2018年2月至2019年2月经奥司他韦和法匹拉韦联合治疗的重症流感患者，在治疗期间纵向收集呼吸道样本。同时还收集一组未经任何抗病毒药物治疗流感病毒感染患者呼吸道样本作为对照。对所有样本进行流感病毒全基因组测序，分析联合治疗中流感病毒核苷酸多样性及非同义突变的意义。
研究结果
联合治疗重症流感患者的临床特点
本研究纳入37位经奥司他韦和法匹拉韦联合治疗的重症流感患者，采集306份呼吸道样本，最终来自19位患者的62份样本完成了流感病毒全基因组测序（图1B），包括35份痰液，15份咽拭子，7份肺泡灌洗液，4份鼻咽拭子和1份气道吸出物。患者的平均年龄为60岁，13/19（68%）为男性，6/19（32%）的患者住院期间进行了气管插管，4/19（21%）患者死亡。同时采集来自20位未经治疗的流感患者的20份呼吸道样本作为对照组，包括14份鼻咽拭子，5份口咽拭子，1份痰样本。对照组的平均年龄为56岁，8/20（40%）为男性，其中2/20（10%）来自急诊科，剩下的18/20（90%）是住院患者，在这其中，17/18（94%）来自普通病房，1/20（5%）来自ICU。
联合治疗对流感病毒核苷酸多样性影响较小
联合治疗组共62例样本完成全基因组测序，总体平均Ct值为25。每个样本的平均测序深度为9964，测序reads的平均长度为212bp（图1C-D）。系统进化树分析显示，两组患者中流感病毒均属于甲型H1N1病毒pdm09进化支6B.1A。在联合治疗期间，病毒核苷酸多样性相对稳定（P>0.05），但在第5天略有增加，然后迅速下降（图2A）。虽然联合治疗组和对照组两组间的流感病毒全基因组核苷酸多样性没有显著差异（P>0.05）（图2B），但对照组的流感病毒核苷酸多样性略高。同样，与联合治疗组相比，对照组的大部分流感片段的核苷酸多样性稍高，但除PA外两组之间没有差异（图2C）。
图1研究假设（A）。研究设计，从接受联合治疗的流感病毒感染患者中纵向收集呼吸道样本并进行流感病毒全基因组测序。在不同的时间点采集样本，包括治疗前（第1天）和治疗后第2，5，7，10天（B）。不同的时间点样本中流感病毒的CT值、测序深度和reads长度（C-E）。
图2 联合治疗组中不同时间点流感病毒基因组的核苷酸多样性（A）。联合治疗与对照组全基因组流感病毒多样性的差异（B）。联合治疗与对照组8个流感病毒片段的多样性比较（C）。*P≤0.05，**P≤0.01，“ns”表示无显著性差异。
大多数非同义突变来源于NA和HA
在大部分流感病毒基因片段（联合治疗后）中，同义突变比非同义突变更为普遍（图3A）。在联合治疗组鉴定的174种非同义氨基酸取代中，NA和HA中的非同义突变最多，分别含有44个（25.3%）和43个（24.7%）突变，其次是NP，19个（10.9%），PA和PB2在每个片段中有17个（9.8%）突变，PB1有14个（8.0%）突变，NS有11个（6.3%）突变以及MP有9个（5.2%）突变（图3B）。对突变类型进行分析，在流感病毒8个基因片段中，转换比颠换更为常见（图3C）。既往研究报道表示核苷酸类似物可能导致突变侧重于特定的核苷酸变换。在12类碱基替换中，最常见的是G→A、A→ G、C→T和T→C，G/A转换比例（G→A，27%；A→G，25%）高于C/T（C→T，18%；T→C，16%）转换（图3D-E）。
图3 联合治疗组的流感病毒突变特征（大多数样本在第2，5，7和10天收集，另外两个样本在第3天和第4天采集）。所有样本中流感病毒8个片段的非同义和同义突变数目（A）。所有样本中8个片段的非同义突变类型数目（B）。所有样本中流感病毒8个片段的转换和颠换突变的数目（C）。所有样本中不同碱基置换的占比（D）。每个样本中不同碱基置换的数目（E）。
联合治疗组中发现的部分突变位于流感病毒关键位点
在PubMed数据库中检索在联合治疗组中发现的所有非同义突变，来解释其潜在的生物学效应，如耐药位点或位于抗原位点。我们在关键位点检索发现46个（26%）突变，包括HA片段中18个（39%），其次是NA（13，28%），PB1（5，11%）和PB2（5，11%），有助于病毒适应、抗病毒耐药或抗原漂移。在HA的18个非同义突变中，有11个位于抗原位点。既往报道可增加聚合酶活性的A343T（PA），K361R（PA）和K480R（PB1）三个突变也在本研究中检测到，且在联合治疗期间，PA中的A343T和K361R在第2，5和7天持续存在。其次，分别在15，4，4位患者的流感病毒PB2片段中检测到K526R，R251K和V511I突变，既往报道表明这三种突变可增强流感病毒复制能力。另外I353V（NP）可增加致病性，K351R（NP）可降低聚合酶活性，同时出现在一名患者中。
联合治疗无法抑制奥司他韦耐药突变比例增加
通过文献检索整理了29个与奥司他韦敏感性降低相关的NA片段中的突变。其中，在1名患者的4个样本中检测到H275Y，且在抗病毒治疗期间突变比例越来越高。在抗病毒治疗前的第1天，野生型H275基因型占病毒总reads数的94.6%，在检测到的6454个reads中，只检测到少量的275Y（5.4%）突变体。然而，携带H275Y的突变株不断生长，其比例迅速增加。联合治疗后第4天和第7天，H275Y突变比例分别增加到67.4%和99.2%（图4）。所以随着治疗时间延长，突变毒株的比例逐渐增加表明联合治疗不能抑制奥司他韦耐药突变的增加。
图4 H275Y突变在治疗期间的比例变化
结论
本研究通过对经奥司他韦和法匹拉韦联合治疗的重症流感患者呼吸道样本进行全基因组分析，发现与未接受抗病毒治疗的患者相比，奥司他韦和法匹拉韦联合治疗对病毒多样性的影响较小。另外联合治疗可以阻止病毒进化的趋势，但不能抑制奥司他韦耐药突变比例的增加。
